一、实验目的

在疫情应急期间，细胞水平评价克咳胶囊药粉抗SARS-CoV-2效果。

二、实验材料：

1.受试药物：1种，克咳胶囊药粉。

2. 细胞：Vero E6细胞，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存。

3. 病毒：SARS-CoV-2，滴度为10⁵TCID₅₀/ml，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度为100TCID₅₀。

三、实验方法：

（一）样品准备

1.     受试药物：  

药物名称：克咳胶囊

药物浓度：/   （委托方指定浓度，本报告仅对送检样本负责）

药物生产厂家：贵州益佰制药股份有限公司

药物批号：/

药物生产日期：/

药物有效期：/

（二）受试药物细胞毒性实验

（1）   无菌96孔培养板，每孔加入100µl浓度为5×10⁴cell/ml Vero E6细胞，37℃ 5% CO₂培养24小时；

（2）   药物用DMEM培养基（含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶）分别倍比系列稀释，原倍，1:2，1:4……1:128共8个稀释度；

（3）   弃去96孔培养板中细胞培养液，分别加入稀释好的药物，每孔100µl，每浓度4个复孔，每孔再加入100µl DMEM培养基（含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶）；

（4）   同时设立细胞对照：每孔200µl DMEM培养基（含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至长成单层的Vero E6细胞96孔培养板中，共4个复孔。

（5）   37℃ 5％CO₂孵箱孵育3天；

（6）   光学显微镜下观察细胞病变（CPE），细胞有CPE变化记为“+”，细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。

（三）受试药物抗病毒实验

（1）无菌96孔培养板，每孔加入100µl浓度为5×10⁴cell/ml Vero E6细胞，37℃ 5%CO₂培养24小时；

（2）受试药物稀释成5个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100µl，然后每孔再加入等体积100 TCID₅₀病毒，37℃，5% CO₂孵箱作用1h；

（3）1h后，弃去96孔培养板中细胞培养液，加入上述混合液；

（4）同时设立细胞对照、病毒对照；

细胞对照：每孔200µl DMEM培养基（含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶）加入至长成单层的Vero E6细胞96孔培养板中，共4个复孔。

病毒对照：每孔100µl DMEM培养基（含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶），再加入等体积100 TCID₅₀病毒，共4个复孔，37℃作用1h，1h后弃去96孔培养板中细胞培养液，加入上述病毒液。

（5）细胞37℃，5% CO₂孵箱孵育4-5天；

（6）光学显微镜下观察细胞病变（CPE），细胞有CPE变化记为“+”，细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。

（四）实验条件：以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

（五）药物效果计算：

1. 药物对细胞半数毒性浓度(CC₅₀)的计算：

CC₅₀ = Antilog(D + × C)

A: 大于50%细胞病变率的百分数，B:小于50%细胞病变率的百分数，C: log(稀释倍数)，D: log(小于50%细胞病变率所对应的药物浓度)

2. 药物抑制病毒百分率：

药物抑制病毒百分率% =  ×100%

3. 药物抑制病毒半数有效浓度(EC₅₀)

EC₅₀ = Antilog(D+     ×C)

A: 大于50%抑制率的百分数，B: 小于50%抑制率的百分数，C: log(稀释倍数)，D: log(小于50%抑制率所对应的药物浓度)

如药物无抑制病毒作用将无法测得EC_50.

4. 选择指数(SI)

SI   = 

（六）药效评价指标：

选择指数（Selection Index，SI）：指药物对细胞50％毒性浓度与对病毒50％抑制浓度的比值(CC₅₀/EC₅₀)，或者表示药物对细胞最大无毒浓度与对病毒最小有效浓度的比值(CC₀/EC₀)。选择指数越大安全性越高。

四、实验结果：

（一）受试药物细胞毒性实验

药物分别设置8个浓度，细胞毒性测定结果显示受试物在2000μg/mL及以上浓度对细胞有毒性，结果见表 1，根据药物毒性CC₅₀计算公式，得出CC₅₀=1412.54μg/mL。

表1. 药物毒性结果

“+”为细胞有CPE变化，“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。

（二）受试药物抗病毒实验

       药物分别设置5个浓度，受试药物5个浓度在细胞上均无对病毒抑制效果，见表2，未测得EC₅₀。

表2. 药物抗SARS-CoV-2效果

“+”为细胞有CPE变化，“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态，“/”为细胞细胞毒性

五、结论：

        根据细胞水平的筛选结果，计算克咳胶囊药粉的CC₅₀为1412.54μg/mL，该受试物在1000μg/mL浓度及以下时，对SARS-CoV-2病毒均无抑制作用。体外实验未获得EC₅₀。