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中国医学科学院医学实验动物研究所 SARS-CoV-2体外筛选实验报告

Release time:2020-03-22 18:50:12 Already 106 person browsed

一、实验目的

在疫情应急期间,细胞水平评价克咳胶囊药粉抗SARS-CoV-2效果。

二、实验材料:

1.受试药物:1种,克咳胶囊药粉。

2. 细胞:Vero E6细胞,由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存。

3. 病毒:SARS-CoV-2,滴度为105TCID50/ml,由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80保存。使用病毒滴度为100TCID50

三、实验方法:

(一)样品准备

1.     受试药物:  

药物名称:克咳胶囊

药物浓度:/   (委托方指定浓度,本报告仅对送检样本负责)

药物生产厂家:贵州益佰制药股份有限公司

药物批号:/

药物生产日期:/

药物有效期:/

(二)受试药物细胞毒性实验

(1)   无菌96孔培养板,每孔加入100µl浓度为5×104cell/ml Vero E6细胞,37 5% CO2培养24小时;

(2)   药物用DMEM培养基(含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶)分别倍比系列稀释,原倍,1:21:4……1:1288个稀释度;

(3)   弃去96孔培养板中细胞培养液,分别加入稀释好的药物,每孔100µl,每浓度4个复孔,每孔再加入100µl DMEM培养基(含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶);

(4)   同时设立细胞对照:每孔200µl DMEM培养基(含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶)加入至长成单层的Vero E6细胞96孔培养板中,共4个复孔。

(5)   375CO2孵箱孵育3天;

(6)   光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞有CPE变化记为“+”,细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”

(三)受试药物抗病毒实验

1无菌96孔培养板,每孔加入100µl浓度为5×104cell/ml Vero E6细胞,37 5%CO2培养24小时;

2)受试药物稀释成5个浓度,每个浓度4个复孔,每孔100µl,然后每孔再加入等体积100 TCID50病毒,375% CO2孵箱作用1h

31h后,弃去96孔培养板中细胞培养液,加入上述混合液;

4)同时设立细胞对照、病毒对照;

细胞对照:每孔200µl DMEM培养基(含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶)加入至长成单层的Vero E6细胞96孔培养板中,共4个复孔。

病毒对照:每孔100µl DMEM培养基(含2%双抗和16μg/ml胰蛋白酶),再加入等体积100 TCID50病毒,共4个复孔,37℃作用1h1h弃去96孔培养板中细胞培养液,加入上述病毒液

5)细胞375% CO2孵箱孵育4-5天;

6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞有CPE变化记为“+”,细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”

(四)实验条件:以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

(五)药物效果计算:

1. 药物对细胞半数毒性浓度(CC50)的计算:

CC50 = Antilog(D + × C)

A: 大于50%细胞病变率的百分数,B:小于50%细胞病变率的百分数,C: log(稀释倍数)D: log(小于50%细胞病变率所对应的药物浓度)

2. 药物抑制病毒百分率:

药物抑制病毒百分率% =  ×100%

3. 药物抑制病毒半数有效浓度(EC50)

EC50 = Antilog(D+     ×C)

A: 大于50%抑制率的百分数,B: 小于50%抑制率的百分数,C: log(稀释倍数)D: log(小于50%抑制率所对应的药物浓度)

如药物无抑制病毒作用将无法测得EC50.

4. 选择指数(SI)

SI   = 

(六)药效评价指标:

选择指数(Selection IndexSI):指药物对细胞50%毒性浓度与对病毒50%抑制浓度的比值(CC50/EC50),或者表示药物对细胞最大无毒浓度与对病毒最小有效浓度的比值(CC0/EC0)。选择指数越大安全性越高。

 

四、实验结果:

(一)受试药物细胞毒性实验

药物分别设置8个浓度,细胞毒性测定结果显示受试物在2000μg/mL及以上浓度对细胞有毒性,结果见表 1,根据药物毒性CC50计算公式,得出CC50=1412.54μg/mL

1. 药物毒性结果

受试药物名称

浓度(μg/mL

结果(4个复孔)

 

 

 

克咳药粉

8000

+

+

+

+

4000

+

+

+

+

2000

+

+

+

+

1000

-

-

-

-

500

-

-

-

-

250

-

-

-

-

125

-

-

-

-

62.5

-

-

-

-

细胞对照

200µlDMEM

-

-

-

-

“+”为细胞有CPE变化,“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。

(二)受试药物抗病毒实验

       药物分别设置5个浓度,受试药物5个浓度在细胞上均无对病毒抑制效果,见表2,未测得EC50

2. 药物抗SARS-CoV-2效果

受试药物名称

浓度(μg/mL

结果(4个复孔)

 

 

克咳药粉

1000

+

+

+

+

500

+

+

+

+

250

+

+

+

+

125

+

+

+

+

62.5

+

+

+

+

细胞对照

200µlDMEM

-

-

-

-

病毒对照

100TCID50

+

+

+

+

“+”为细胞有CPE变化,“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态,/为细胞细胞毒性

五、结论:

        根据细胞水平的筛选结果,计算克咳胶囊药粉的CC501412.54μg/mL,该受试物在1000μg/mL浓度及以下时,对SARS-CoV-2病毒均无抑制作用。体外实验未获得EC50


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